Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)
Rodzaj reakcji PCR, która pozwala amplifikować wiele sekwencji jednocześnie (do 40) przy użyciu jednej pary starterów. Każdy ze starterów (nie hybrydyzują one z badanym DNA) połączony jest z sekwencją oligonukleotydową, która hybrydyzuje do badanej sekwencji. Jedynie w przypadku, gdzie oba fragmenty oligonukleotydowe przyłączą się do sekwencji docelowych, mogą one zostać zligowane do kompletnej sondy. Korzyścią rozbijania sond na dwie części jest to , iż tylko przyłączone oligonukleotydy ulegają amplifikacji, tym samym produkt namnażania sekwencji odzwierciedla obecność konkretnych sekwencji w badanych próbce. Rozróżnienie sekwencji między sobą następuje dzięki wypełniaczom, które mieszczą się między sondą a jednym ze starterów. Rozdział produktów takiej reakcji przeprowadza się przy pomocy elektroforezy kapilarnej, co zapobiega ograniczeniom rozdzielczości badanych sekwencji obecnych w PCR-multipleks. Starter lewy do namnażania sondy jest znakowany fluorescencyjnie, każdy amplikon tworzy sygnał fluorescencyjny, który może być wykryty przez sekwenator kapilarny. MLPA w szybki i dokładny sposób wykrywa delecje i insercje w genomie. Poza tym z jej pomocą można określić względną liczbę kopii wszystkich eksonów w obrębie genu z wysoką czułością. Technika ta znalazła zastosowanie w:
- diagnostyce molekularnej (np. testowaniu mutacji DMD, BRCA1, NF1, TSC2);
- badaniu stanu metylacji
- analizie liczny kopii genu obszarów zduplikowanych
- profilowaniu ekspresji
- genotypowaniu transgenów
Literatuta
- Kozlowski P, Jasinska AJ, Kwiatkowski DJ. "New applications and developments in the use of multiplex ligation-dependent probe amplification." Electrophoresis. 2008 Dec;29(23):4627-36