Ćwiczenie: Dokowanie Ligandów

Wstęp.

Celem ćwiczenia jest zbadanie sposobów wiązania się carazololu (typowego antagonisty receptorów adrenergicznych) do receptora β₂-adrenergiczneg z zastosowaniem programu AutoDock. Receptory adrenergiczne, podobnie jak rodopsyna, należą do rodziny A receptorów GPCR. Receptory te zlokalizowane są w dużej liczbie tkanek i narządów człowieka, między innymi w centralnym układzie nerwowym, wątrobie, trzustce, nerkach, płytkach krwi i w oku. Typowymi endogennymi ligandami tych białek są hormony, takie jak adrenalina (epinefryna) oraz noradrenalina (norepinefryna). Receptory adrenergiczne biorą udział w kaskadach sygnalizacyjnych: regulujących poziom ciśnienia tętniczego, odpowiadających za częstość skurczów serca, wpływających na funkcje oddechowe oraz mobilizację organizmu do obrony. Receptory adrenergiczne dzielimy na dwa typy α i β. Ponadto w każdej z rodzin, występuje kilka podtypów danego receptora, które różnią się między sobą lokalizacją w organizmie, selektywnością w wiązaniu ligandów, a także sposobem przekazywania sygnału przez białka G.

Poniższe ćwiczenie pokazuje od strony praktycznej jak do miejsca wiążącego białka można zadokować ligand korzystając z progarmu AutoDock oraz pakietu ADT (AutoDockTools). Szczegółowe informacje na temat metod wykorzystywanych w programach AutoDock oraz AutoGrid można znaleźć tutaj.

Przygotowanie receptora oraz liganda.

Strukturę receptora pobrać można z bazy PDB (ang. Protein Data Bank), PDB ID: 2RH1. W pobranym pliku 2RH1.pdb oprócz innych cząsteczek zapisana jest struktura przestrzenna receptora β₂-adrenergicznego.

1. Strukturę samego receptora należy zachować w osobnym pliku receptor.pdb (reszty od ASP29 do LEU342)
2. Współrzedne liganda do pobrania: receptor

Instalacja programu AutoDock oraz ADT (AutoDockTools).

1. Program AutoDock należy pobrać ze strony: http://autodock.scripps.edu/downloads a następnie zainstalować go zgodnie z instrukcją
2. Program ADT należy pobrać ze strony: http://autodock.scripps.edu/downloads/resources/adt/index_html a następnie zainstalować go zgodnie z instrukcją.

Wczytanie struktury receptora i liganda.

1. Należy stworzyć folder (np.: .\dokowanie)w którym będziemy przechowywać wszystkie pliki wymagane przez program AutoDock i ADT a następnie przekopiować tam nasze dwa pliki receptor.pdb oraz ligand.pdb:
2. Uruchom program ADT umożliwiający przygotowanie wszystkich potrzebnych plików do programów autogrid4.exe oraz autodock4.exe
3. W programie ADT określ folder w którym będą przechowywane wszystkie pliki:
   • File > Preferences > Modify Defaults (następnie określ lokalizację stworzonego katalogu z plikami np.: C:\dokowanie)
4. Wczytaj strukturę liganda:
   • Ligand > Input > Open > ligand.pdb
5. Dodaj polarne wodory do liganda. W tym celu należy najpierw zmienić typ atomu azotu znajdującego się w sąsiedztwie grupy –OH liganda:
   • Edit > Atoms > Edit Type > (tu należy kliknąć na atom azotu i zmienić jego typ z „Npl” na „N3+”)
6. Następnie dodaj polarne wodory:
   • Edit > Hydrogens > Add > Polar Only
7. Zachowaj strukturę liganda z dodanymi wodorami:
   • File > Save > Write PDB > (zachowaj jako ligand_h.pdb)
8. Skasuj ligand:
   • Edit > Delete > Delete All Molecules
9. Wczytaj strukturę ligand z dodanymi wodorami:
   • Ligand > Input > Open > ligand_h.pdb
10. Określ wiązania ruchome liganda:
    • Ligand > Torsion Tree > Detect Root
11. Zapisz ligand w formacie *.pdbqt:
    • Ligand > Output > Save as PDBQT > ligand.pdbqt
12. Wczytanie receptora:
    • File > Read Macromolecule > receptor.pdb
13. Dodaj polarne wodory do receptora:
    • Edit > Hydrogens > Add > Polar Only
14. Następnie zapisz receptor w formacie PDBQT:
    • Flexible Residues > Chose Macromolecule > receptor.pdb
    • File > Save > Write PDBQT > receptor.pdbqt
    • Edit > Delete > Delete All Molecules

Obliczenie siatki potencjałów z zastosowaniem procedury AutoGrid.

AutoGrid tworzy trójwymiarową siatkę obejmującą obszar miejsca wiążącego białka. Następnie, atom próbkujący umieszczany jest w każdym węźle siatki. Energia oddziaływania danego atomu z białkiem jest zapisywana kolejno na każdym węźle siatki. Procedura powtarzana jest dla każdego z typów atomów obecnych w ligandzie. W ten sposób tworzone są siatki potencjałów dla wszystkich typów atomów liganda, siatka potencjałów elektrostatycznych oraz siatka potencjałów opisująca energię desolwatacji. Tak otrzymane mapy potencjałów są następnie wykorzystywane przez program AutoDock do oszacowania energii wiązania liganda

1. Wczytaj strukturę receptora i liganda w formacie PDBQT:
   • Grid > Macromolecule > Open > receptor.pdbqt
   • Grid > Set Map Types > Open Ligand > ligand.pdbqt
2. Określ dla jakich typów atomów będą liczone siatki:
   • Grid > Set Map Types > Directly > Accept
3. Zdefiniuj położenie i rozmiar siatki. Miejsce wiązania ligandów w receptorach GPCR znajduje się we wnęce między helisami. Należy tak dobrać parametry siatki aby pokrywała ona całe miejsce wiążące receptora. Nie zapomnij zachować parametrów siatki w oknie Grid Options:
   • Grid Box > (przykładowe parametry siatki widoczne na obrazku).
     

     Prametry opisujące trójwymiarową siatkę
   • File > Close saving current
4. Zachowaj plik GPF.gpf:
   • Grid > Output > Save GPF > GPF.gpf
5. Uruchom program AutoGrid:
   • Run > Run AutoGrid > (określ katalog w którym znajdują się wszystkie pliki oraz katalog w którym został zainstalowany program AutoGrid4.exe)

PRZYKŁADOWE PARAMETRY DO PROGRAMU AUTOGRID:

npts 126 126 124                     # num.grid points in xyz
gridfld receptor.maps.fld            # grid_data_file
spacing 0.197222222222               # spacing(A)
receptor_types A C HD N OA SA        # receptor atom types
ligand_types A C OA HD N             # ligand atom types
receptor receptor.pdbqt              # macromolecule
gridcenter -29.978 9.602 7.103       # xyz-coordinates or auto
smooth 0.5                           # store minimum energy w/in rad(A)
map receptor.A.map                   # atom-specific affinity map
map receptor.C.map                   # atom-specific affinity map
map receptor.OA.map                  # atom-specific affinity map
map receptor.HD.map                  # atom-specific affinity map
map receptor.N.map                   # atom-specific affinity map
elecmap receptor.e.map               # electrostatic potential map
dsolvmap receptor.d.map              # desolvation potential map
dielectric -0.1465                   # <0, AD4 distance-dep.diel;>0, constant

Dokowanie liganda z wykorzystaniem procedury AutoDock.

Aby wykonać dokowanie z zastosowaniem procedury AutoDock należy przygotować plik DPF.dpf z parametrami określającymi procedurę dokowania.

1. Określ strukture receptora:
   • Docking > Macromolecule > Set Rigid Filename > receptor.pdbqt
2. Określ strukturę liganda:
   • Docking > Choose > ligand > Accept
3. Zapisz plik DPF.dpf:
   • Docking > Output > Lamarckian GA > DPF.dpf
4. Zadokuj ligand korzystając z procedury AutoDock:
   • Run > Run AutoDock > (określ katalog w którym znajdują się wszystkie pliki oraz katalog w którym został zainstalowany program AutoDock4.exe)

PRZYKŁADOWE PARAMETRY DO PROGRAMU AUTODOCK:

autodock_parameter_version 4.2       # used by autodock to validate parameter set
outlev 1                             # diagnostic output level
intelec                              # calculate internal electrostatics
seed pid time                        # seeds for random generator
ligand_types A C OA HD N             # atoms types in ligand
fld receptor.maps.fld                # grid_data_file
map receptor.A.map                   # atom-specific affinity map
map receptor.C.map                   # atom-specific affinity map
map receptor.OA.map                  # atom-specific affinity map
map receptor.HD.map                  # atom-specific affinity map
map receptor.N.map                   # atom-specific affinity map
elecmap receptor.e.map               # electrostatics map
desolvmap receptor.d.map             # desolvation map
move ligand.pdbqt                    # small molecule
about -29.8396 9.3008 7.0263         # small molecule center
tran0 random                         # initial coordinates/A or random
axisangle0 random                    # initial orientation
dihe0 random                         # initial dihedrals (relative) or random
tstep 2.0                            # translation step/A
qstep 50.0                           # quaternion step/deg
dstep 50.0                           # torsion step/deg
torsdof 7                            # torsional degrees of freedom
rmstol 2.0                           # cluster_tolerance/A
extnrg 1000.0                        # external grid energy
e0max 0.0 10000                      # max initial energy; max number of retries
ga_pop_size 150                      # number of individuals in population
ga_num_evals 25000000                # maximum number of energy evaluations
ga_num_generations 27000             # maximum number of generations
ga_elitism 1                         # number of top individuals to survive to next generation
ga_mutation_rate 0.02                # rate of gene mutation
ga_crossover_rate 0.8                # rate of crossover
ga_window_size 10                    # 
ga_cauchy_alpha 0.0                  # Alpha parameter of Cauchy distribution
ga_cauchy_beta 1.0                   # Beta parameter Cauchy distribution
set_ga                               # set the above parameters for GA or LGA
sw_max_its 300                       # iterations of Solis & Wets local search
sw_max_succ 4                        # consecutive successes before changing rho
sw_max_fail 4                        # consecutive failures before changing rho
sw_rho 1.0                           # size of local search space to sample
sw_lb_rho 0.01                       # lower bound on rho
ls_search_freq 0.06                  # probability of performing local search on individual
set_psw1                             # set the above pseudo-Solis & Wets parameters
unbound_model bound                  # state of unbound ligand
ga_run 100                           # do this many hybrid GA-LS runs
analysis                             # perform a ranked cluster analysis